第19章 钱余的计划（3）64（1 / 2）

人们开发的这项“CRISPR/Cas9”技术，源自原核生物的一种天然免疫系统。

其中，“CRISPR”是指“规律成簇的间隔短回文重复”（ClusteredRugularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），它是原核生物基因组内部的一段序列。

当病毒入侵原核生物时，会将自己的“一段序列”整合到原核生物体内，让后者为自己提供“养分”，使得病毒自身的基因得以复制。而这“一段序列”，正好与CRISPR序列相匹配。

为了抵御病毒的入侵，原核生物将病毒的这“一段序列”储存至自身，将其作为“对感染的记忆”。当它再次遭遇病毒时，便能够对入侵者加以“识别”，将病毒的这“一段序列”进行切割，使其失去作用。

而“Cas”是指“与CRISPR相关”（CRISPR-associated），这些“Cas”编码的“Cas蛋白”，就具有切割病毒基因的功能——“Cas9蛋白”就是其中的一员。

那么原核生物的CRISPR序列，是如何引导Cas9上前，继而进行切割作业的呢？

答案是“RNA分子的相互作用”。

CRISPR序列转录加工为RNA分子，该RNA与自身反式激活形式的RNA组成复合物，Cas9能够识别并结合其序列，最后对其进行切割。

当年顺际宁越讲越兴奋：“现在呀，不管是细胞，还是各类动物、植物，几乎都能用CRISPR/Cas9进行‘基因定点编辑’，算得上是‘指哪打哪’啦——‘切断’了特定的基因，也就相当于突变体咯。”

“我有预感，这项技术迟早是要拿诺贝尔奖的！”

顺际宁对其十分看好：“我已经和尹老师商量过了，等我们拿到了特定的载体，就可以自行使用CRISPR/Cas9体系，试着给斑马鱼做基因编辑。”

事实证明，顺际宁确实很有远见。

2020年10月，CRISPR/Cas9系统的其中两位开发者，最终被授予了诺贝尔化学奖——短短8年间，全世界形形色色的分子生物学实验室，几乎都在使用这项技术。钱余、陈幸、郭子昱、帅小伙……无论研究何物种，科研人员都能利用CRISPR/Cas9体系，进行基因切割操作。

章程澜问道：“钱老师，您当年在高校里，是怎么获得突变体的呀？”

“要想开展‘突变体计划’，我们首先需要运用不同的技术手段，获得大量斑马鱼的突变体——当年，我们其实尝试过好几种方式。”

钱余接着问道：“大家……都知道哪些斑马鱼的基因突变技术呢？”

学生们七嘴八舌，纷纷抢答。

“可以对斑马鱼进行ENU化学诱变处理。”

“还有TALEN靶向基因敲除技术。”

“可以利用CRISPR/Cas9系统！”

“还可以导入‘外源片段’，通过‘荧光蛋白体系’，将其作为‘报告基因’，大规模筛选‘转基因鱼’。”

听完学生们的答案，钱余赞许地点了点头：“那我们今天先来说说，如何获得斑马鱼突变体吧。”

“其实大家刚刚提到的这些操作，可以大致分为‘正向遗传学’和‘反向遗传学’两类手段。”

正向遗传学，是通过自发突变或者人工诱变技术，由个体表型、性状的改变，从而寻找引起此变化的对应突变基因。

“正向遗传学是从表型的改变入手，进而确定基因的变化。简而言之，就是我们得到了一些‘长得与众不同’的斑马鱼，继而找出引起它们‘外貌变化’的‘祸首基因’。”

大规模的随机突变，就是正向遗传学常用的手段——譬如，帅小伙开展的拟南芥种子“EMS化学诱变”。

“对于斑马鱼而言，‘ENU诱变’、逆转录病毒介导的‘插入突变’、转座子介导的‘基因/增强子诱捕突变’，都属于正向遗传学的研究手段。”

其中，ENU即“N-乙基-N-亚硝基脲”，是一种人工合成的烷化剂，能导致多种生物的DNA分子，发生随机的单碱基突变——通过烷化反应，ENU将乙烷基转移至DNA碱基的氧原子或者氮原子上，在DNA进行复制时，致使碱基错配或置换。

因此ENU也如同EMS诱变剂，同样被列入了致癌物清单。

“而逆转录病毒介导的突变原理，则是将外源DNA导入斑马鱼基因组，实现整合后，导致插入位点所对应的基因无法正常表达。”

钱余继续开了口：“虽然逆转录病毒介导的插入突变，可将DNA片段作为‘分子标记’，简化了后续突变基因定位、鉴定的程序——但这一操作引起的突变效率，远不如ENU化学诱变。”

“于是，有更多的研究者倾向于利用转座子，寻找新的未知基因。”

转座子，又称“跳跃基因”，它是一类可自行复制，在染色体间进行“跳跃移动”的DNA序列。例如，它能从染色体的一个位置，转移至另一个位置上。这一现象，会给基因组引进新的遗传因素——包括基因的缺失、重复、倒位、DNA重排等等。

“在斑马鱼的研究体系里，常用的有‘Tol2’和‘睡美人SleepingBeauty’两种转座子，它们能够将外源DNA进行‘复制/剪切’，然后‘粘贴’整合至基因组中。同时通过‘荧光蛋白报告基因’系统，让研究者得以进行大规模筛选，得到具有‘组织表达特异性’的‘转基因’斑马鱼……”

介绍完正向遗传学的常规手段，接下来的内容，就属于反向遗传学的范畴了。

“反向遗传学，是通过‘改变’某‘特定’基因，例如开展碱基的插入、替换、缺失、点突变等，进而确定这些‘DNA重组’操作，对于个体表型和性状的影响。”

如果把正向遗传学比作一项“由表及里”的工程，那么反向遗传学，就是另外一条“由里及表”的路线了。

帅小伙所述的SALK生物研究所，其在TAIR网站贩卖的拟南芥T-DNA插入突变体，就是一个应用反向遗传学的成功案例。

“开展反向遗传学的研究，是在获知斑马鱼基因组的序列前提下实施的。”

钱余接着往下讲解。

“我们可以利用‘锌指核酸酶ZFN’技术，以及‘转录激活因子样效应物核酸酶TALEN’技术，或者‘CRISPR/Cas9’系统——它们都属于反向遗传学常用的手段。”

如今，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9已经是“基因组编辑”的“三大利器”，它们能让研究人员针对“靶标序列”，实行“精准敲除”。

“这几项技术，都涉及了DNA双链损伤、断裂后的两种修复机制。”